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AAT 13479--AAT 蛋白酶熒光底物 Ac-Pro-Ala-Leu-AMC 用戶(hù)指南

更新時(shí)間：2025-06-03 點(diǎn)擊次數(shù)：312

產(chǎn)品概述

AAT 13479--AAT 蛋白酶熒光底物 Ac-Pro-Ala-Leu-AMC 是 AAT Bioquest 公司研發(fā)的一款用于蛋白酶活性檢測(cè)的重要工具。該熒光底物由一個(gè)特定的肽段（Ac-Pro-Ala-Leu）與 7 - 氨基 - 4 - 甲基（AMC）通過(guò)酰胺鍵連接而成。在未被蛋白酶切割時(shí)，AMC 的熒光被抑制；當(dāng)?shù)鞍酌缸饔糜诘孜锏碾亩尾糠郑懈钐囟ǖ碾逆I后，AMC 被釋放，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。該底物適用于多種蛋白酶活性研究，如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究、藥物研發(fā)、疾病診斷等領(lǐng)域，幫助科研人員快速、靈敏地檢測(cè)蛋白酶活性，探究蛋白酶在生理病理過(guò)程中的作用機(jī)制。

技術(shù)原理

蛋白酶作用機(jī)制

蛋白酶是一類(lèi)能夠水解蛋白質(zhì)或多肽中肽鍵的酶，不同類(lèi)型的蛋白酶具有特定的底物特異性，能夠識(shí)別并切割特定氨基酸序列的肽鍵。AAT 13479 熒光底物中的 Ac-Pro-Ala-Leu 肽段，可被具有相應(yīng)底物特異性的蛋白酶識(shí)別。當(dāng)?shù)鞍酌概c底物結(jié)合時(shí)，其活性中心的氨基酸殘基與底物的肽鍵發(fā)生相互作用，通過(guò)親核攻擊等機(jī)制，使肽鍵斷裂，將底物切割成兩部分。

熒光產(chǎn)生原理

在 Ac-Pro-Ala-Leu-AMC 底物中，AMC 基團(tuán)與肽段相連時(shí)，由于其周?chē)幕瘜W(xué)環(huán)境，熒光處于淬滅狀態(tài) 。當(dāng)?shù)鞍酌盖懈铍亩?，AMC 從底物上釋放出來(lái)，其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所處的化學(xué)環(huán)境也隨之改變，從而解除熒光淬滅，在合適的激發(fā)光照射下（激發(fā)波長(zhǎng)通常為 360 - 380nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 440 - 460nm ），能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，可間接反映蛋白酶對(duì)底物的切割程度，進(jìn)而定量分析蛋白酶的活性。熒光強(qiáng)度與蛋白酶的活性呈正相關(guān)，即蛋白酶活性越高，切割底物產(chǎn)生的 AMC 越多，熒光強(qiáng)度也就越強(qiáng)。

產(chǎn)品特點(diǎn)

高靈敏度：該熒光底物對(duì)蛋白酶活性檢測(cè)具有的靈敏度，能夠檢測(cè)到極低濃度的蛋白酶。即使樣本中蛋白酶含量極少，也能通過(guò)釋放的 AMC 產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)，可檢測(cè)到納摩爾（nM）級(jí)別的蛋白酶活性變化，有助于發(fā)現(xiàn)微量蛋白酶在生理或病理過(guò)程中的作用。

良好的特異性：Ac-Pro-Ala-Leu-AMC 針對(duì)特定的蛋白酶或蛋白酶家族設(shè)計(jì)，能夠與目標(biāo)蛋白酶特異性結(jié)合并被切割。在復(fù)雜的生物樣本中，可有效避免與其他非目標(biāo)蛋白酶或蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性反應(yīng)，減少背景信號(hào)干擾，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，確保檢測(cè)到的熒光信號(hào)真實(shí)反映目標(biāo)蛋白酶的活性。

操作簡(jiǎn)便：使用該熒光底物進(jìn)行蛋白酶活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的樣本前處理和儀器設(shè)備。只需將底物與含有蛋白酶的樣本混合，在適宜的條件下孵育，然后通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀等常規(guī)儀器檢測(cè)熒光強(qiáng)度即可，適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)研究。

反應(yīng)快速：底物與蛋白酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)良好，能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成切割反應(yīng) 。通常在幾分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)即可觀(guān)察到明顯的熒光信號(hào)變化，相比傳統(tǒng)的蛋白酶活性檢測(cè)方法（如基于發(fā)色基團(tuán)的底物檢測(cè)），大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率，便于進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和快速篩選實(shí)驗(yàn)。

廣泛的應(yīng)用范圍：可用于多種樣本類(lèi)型的蛋白酶活性檢測(cè)，包括細(xì)胞裂解液、組織勻漿、血清、血漿、尿液等。同時(shí)適用于不同的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景，如研究蛋白酶在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的活性變化、篩選蛋白酶抑制劑或激活劑、評(píng)估藥物對(duì)蛋白酶活性的影響等，為科研人員提供了多樣化的研究手段。

使用方法

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

試劑檢查：收到 AAT 13479--AAT 蛋白酶熒光底物 Ac-Pro-Ala-Leu-AMC 后，檢查包裝是否完好，確認(rèn)標(biāo)簽信息完整，包括產(chǎn)品名稱(chēng)、貨號(hào)、規(guī)格、濃度（如需溶解后確定）、有效期等。將底物短暫離心（低速，如 2000 - 3000 rpm，離心 1 - 2 分鐘），使附著在管蓋上的底物集中于管底，避免損失。觀(guān)察底物外觀(guān)，正常情況下應(yīng)為白色或類(lèi)白色粉末（如為溶液狀態(tài)，應(yīng)澄清無(wú)渾濁、沉淀）。若發(fā)現(xiàn)異常，請(qǐng)勿使用，并及時(shí)聯(lián)系供應(yīng)商處理。

試劑準(zhǔn)備：

底物溶解：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將底物用合適的溶劑溶解。通常推薦使用 DMSO（二甲基亞砜）溶解，配制成高濃度的母液（如 1 - 10 mM）。溶解過(guò)程中，使用移液槍準(zhǔn)確量取溶劑，加入底物管中，輕輕振蕩或渦旋混勻，確保底物溶解。溶解后的母液分裝成小份， - 20℃或 - 80℃避光保存，避免反復(fù)凍融，以防止底物降解。

緩沖液配制：準(zhǔn)備適合蛋白酶活性檢測(cè)的緩沖液，緩沖液的選擇需根據(jù)目標(biāo)蛋白酶的特性確定。例如，對(duì)于大多數(shù)中性 pH 環(huán)境下發(fā)揮活性的蛋白酶，可使用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）；對(duì)于酸性蛋白酶，可使用醋酸緩沖液（pH 4.0 - 5.0）等。緩沖液中可能還需添加必要的輔助成分，如金屬離子（某些蛋白酶需要特定的金屬離子激活）、還原劑（防止半胱氨酸蛋白酶的活性中心被氧化）等，具體成分和濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)經(jīng)驗(yàn)。

樣本準(zhǔn)備：

細(xì)胞樣本：若檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶活性，需收集細(xì)胞并制備細(xì)胞裂解液。首先用胰酶消化貼壁細(xì)胞，或直接收集懸浮細(xì)胞，使用預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 - 3 次，去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的細(xì)胞裂解液（如含蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液），在冰上裂解細(xì)胞 15 - 30 分鐘，期間可輕輕振蕩或渦旋。最后通過(guò)離心（如 12000 rpm，4℃離心 10 - 15 分鐘）收集上清液，即為細(xì)胞裂解液，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

組織樣本：對(duì)于組織樣本，先將組織切成小塊，加入適量的預(yù)冷勻漿緩沖液（如含蛋白酶抑制劑的 PBS），使用組織勻漿器進(jìn)行勻漿處理。勻漿后的組織樣本通過(guò)離心（如 12000 rpm，4℃離心 15 - 20 分鐘）去除組織碎片，收集上清液作為組織勻漿樣本。

體液樣本：血清、血漿、尿液等體液樣本可直接使用，或根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?。若樣本中存在雜質(zhì)或可能干擾實(shí)驗(yàn)的物質(zhì)，可通過(guò)離心（如 3000 rpm，室溫離心 10 分鐘）或過(guò)濾等方法進(jìn)行預(yù)處理。

儀器準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀，確保儀器運(yùn)行正常。使用前對(duì)儀器進(jìn)行預(yù)熱和校準(zhǔn)，設(shè)置合適的檢測(cè)參數(shù)，包括激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)、狹縫寬度（對(duì)于熒光分光光度計(jì)）、檢測(cè)時(shí)間等。根據(jù)儀器操作手冊(cè)，正確安裝比色皿（熒光分光光度計(jì)）或放置微孔板（酶標(biāo)儀）。

實(shí)驗(yàn)操作步驟

反應(yīng)體系配制：在無(wú)菌的微孔板或比色皿中，按照以下順序依次加入各成分（以 200 μL 反應(yīng)體系為例）：

緩沖液：170 μL

樣本（細(xì)胞裂解液、組織勻漿、體液等）：20 μL

底物母液（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)稀釋至合適濃度，如 100 μM）：10 μL

輕輕振蕩或使用移液器吹打混勻，確保反應(yīng)體系均勻。

對(duì)照設(shè)置：為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，需設(shè)置多種對(duì)照：

空白對(duì)照：加入緩沖液、底物，但不加入樣本，用于檢測(cè)底物自身的熒光背景以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的非特異性熒光信號(hào) 。

陰性對(duì)照：加入緩沖液、樣本，但不加入底物，用于檢測(cè)樣本中可能存在的自發(fā)熒光或其他非特異性熒光物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

陽(yáng)性對(duì)照：加入已知活性的蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液和底物，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性和檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。陽(yáng)性對(duì)照的蛋白酶濃度應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和標(biāo)準(zhǔn)品的活性進(jìn)行合理設(shè)置。

反應(yīng)孵育：將配制好的反應(yīng)體系在適宜的溫度下孵育（溫度根據(jù)目標(biāo)蛋白酶的最適溫度確定，如 37℃）。孵育時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮偷鞍酌富钚源笮《ǎ话憧稍O(shè)置為 30 分鐘 - 2 小時(shí) 。在孵育過(guò)程中，可將微孔板或比色皿放置在恒溫振蕩器上，輕輕振蕩，使反應(yīng)更充分，但需注意避免液體濺出。

熒光檢測(cè)：孵育結(jié)束后，將微孔板或比色皿放入熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀中，按照預(yù)先設(shè)置的檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè) 。記錄每個(gè)樣本的熒光值（RFU，相對(duì)熒光單位）。

數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理：首先，從每個(gè)樣本的熒光值中扣除空白對(duì)照的熒光值，得到校正后的熒光值。對(duì)于多個(gè)重復(fù)樣本，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，評(píng)估數(shù)據(jù)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

活性計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法或相對(duì)定量法計(jì)算蛋白酶活性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：使用已知濃度的蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，繪制熒光值與蛋白酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 。根據(jù)樣本的校正熒光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查找對(duì)應(yīng)的蛋白酶濃度，從而計(jì)算出樣本中蛋白酶的活性。

相對(duì)定量法：若只需要比較不同樣本之間蛋白酶活性的相對(duì)差異，可選擇相對(duì)定量法。以某一個(gè)樣本作為參照樣本，計(jì)算其他樣本與參照樣本的熒光值比值，該比值可反映不同樣本中蛋白酶活性的相對(duì)高低。

結(jié)果分析與呈現(xiàn)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和研究目的，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和討論 ?？墒褂脠D表（如柱狀圖、折線(xiàn)圖）直觀(guān)展示不同樣本中蛋白酶活性的差異，結(jié)合生物學(xué)背景知識(shí)，探討蛋白酶活性變化與實(shí)驗(yàn)處理、疾病狀態(tài)等因素之間的關(guān)系。在撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)，詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)處理過(guò)程和結(jié)果分析結(jié)論，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和科學(xué)性。

實(shí)驗(yàn)后處理

試劑保存：剩余的底物母液按照分裝保存的條件，放回 - 20℃或 - 80℃冰箱避光保存。對(duì)于使用過(guò)的緩沖液、樣本等試劑，若不再使用，按照實(shí)驗(yàn)室化學(xué)廢棄物和生物廢棄物處理規(guī)定進(jìn)行分類(lèi)處理，避免污染環(huán)境。

儀器清潔：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按照儀器操作手冊(cè)的要求對(duì)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀進(jìn)行清潔和維護(hù) 。使用合適的清潔劑擦拭儀器表面，清理比色皿或微孔板殘留的液體，確保儀器處于良好的運(yùn)行狀態(tài)，為下一次實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。

注意事項(xiàng)

底物保存與使用：底物應(yīng)嚴(yán)格按照推薦的溫度和條件保存，避免光照和潮濕。從冰箱取出底物母液時(shí)，應(yīng)在冰上融化，待恢復(fù)至室溫后再使用，防止因溫度變化導(dǎo)致底物降解。使用前務(wù)必短暫離心，確保底物全部集中于管底，避免移液誤差。由于 DMSO 易吸潮，在配制底物母液時(shí)，盡量快速操作，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中。

樣本處理：在樣本制備過(guò)程中，要注意保持蛋白酶的活性。使用含蛋白酶抑制劑的裂解液或緩沖液處理樣本，防止樣本中的蛋白酶在處理過(guò)程中發(fā)生自降解或被其他因素激活。對(duì)于新鮮采集的樣本，應(yīng)盡快進(jìn)行處理和檢測(cè)，避免樣本長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致蛋白酶活性變化。同時(shí)，確保樣本的均勻性和代表性，對(duì)于組織樣本，勻漿過(guò)程要充分，對(duì)于體液樣本，混合要均勻。

實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化：不同的蛋白酶具有不同的最適反應(yīng)條件（如溫度、pH、離子濃度等），在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，建議通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳的實(shí)驗(yàn)條件。對(duì)于底物濃度，也需進(jìn)行優(yōu)化，過(guò)高或過(guò)低的底物濃度都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。此外，反應(yīng)時(shí)間的選擇也至關(guān)重要，過(guò)短的反應(yīng)時(shí)間可能導(dǎo)致底物未被充分切割，過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間可能使熒光信號(hào)達(dá)到飽和或出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，需根據(jù)蛋白酶的活性和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行合理調(diào)整。

安全防護(hù)：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的 DMSO 等試劑具有一定的毒性和刺激性，操作時(shí)需佩戴手套、護(hù)目鏡等防護(hù)裝備，在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，避免試劑接觸皮膚和吸入人體。若不慎接觸到皮膚或眼睛，應(yīng)立即用大量清水沖洗，并根據(jù)情況就醫(yī)。同時(shí)，注意實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，防止有害氣體積聚。

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

熒光信號(hào)過(guò)低：

原因：可能是底物濃度過(guò)低、蛋白酶活性低、反應(yīng)時(shí)間不足、樣本中存在抑制劑等。

解決方法：適當(dāng)提高底物濃度，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；檢查樣本中蛋白酶的活性，如確認(rèn)蛋白酶是否失活，可通過(guò)添加陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證；延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，觀(guān)察熒光信號(hào)是否增強(qiáng)；檢查樣本處理過(guò)程中是否引入了蛋白酶抑制劑，如緩沖液中是否誤加了過(guò)量的抑制劑，必要時(shí)更換樣本或調(diào)整緩沖液成分。

熒光信號(hào)過(guò)高（超出檢測(cè)范圍）：

原因：可能是底物濃度過(guò)高、樣本中蛋白酶活性過(guò)高、反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等。

解決方法：降低底物濃度，對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)；減少樣本用量或選擇活性較低的樣本；縮短反應(yīng)時(shí)間，重新設(shè)置孵育時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 。

空白對(duì)照熒光值過(guò)高：

原因：可能是底物自身純度不高、DMSO 污染、實(shí)驗(yàn)器材污染、緩沖液中存在熒光物質(zhì)等。

解決方法：檢查底物的質(zhì)量和純度，必要時(shí)更換新的底物；使用新開(kāi)封的 DMSO 配制底物；對(duì)實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行清洗和消毒，或更換新的器材；重新配制緩沖液，確保所用試劑無(wú)熒光雜質(zhì) 。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差：

原因：可能是樣本不均勻、操作誤差、實(shí)驗(yàn)條件不穩(wěn)定等。

解決方法：確保樣本充分混合均勻，對(duì)于組織樣本可增加勻漿次數(shù)；規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，減少移液誤差、溫度控制誤差等；保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境穩(wěn)定，使用恒溫恒濕設(shè)備，確保每次實(shí)驗(yàn)的條件一致。